微生物实验用菌种如何保存方法（二）
3.2.2 液体石蜡保存法：将液体石蜡分装于三角烧瓶内，塞上棉塞，并用牛皮纸包扎， 121℃灭菌30分钟，然后放在40℃温箱中，使水汽蒸发掉，备用。将需要保藏的菌种，在适宜的斜面培养基中培养，使得到健壮的菌体或孢子。用灭菌吸管吸取灭菌的液体石蜡，注入已长好菌的斜面上，其用量以高出斜面顶端1cm为准，使菌种与空气隔绝。将试管直立，置低温或室温下保存（有的微生物在室温下比冰箱中保存的时间还要长）。
大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、假单胞杆菌属、沙门氏菌属、副伤寒沙门氏菌、李斯特氏菌属、蜡样芽胞杆菌、八叠球菌、短芽孢杆菌、大肠杆菌hb101、大肠杆菌dh、猪肺疫、禽多杀性巴氏杆菌（禽霍乱）、猪丹毒、大肠杆菌o157、大肠菌群、产气肠杆菌、志贺氏菌属；接种于半固体培养基上，36±1℃培养18-24小时，加入无菌石蜡油覆盖，保存于2-8℃冰箱或室温中。可保存1-2年。注：副溶血性弧菌接种于含盐的半固体培养基上，36±1℃培养18-24小时，加入无菌石蜡油覆盖，保存于室温。
产气荚膜梭菌、梭杆菌属、拟杆菌属等厌氧菌、厌氧消化链球菌：接种于cdc厌氧菌琼脂中，培养18-24小时，加入无菌石蜡油覆盖，保存于2-8℃冰箱或室温中。可保存1-2年。酵母菌：接种于ypd培养基中，28℃培养24-48小时，加入无菌石蜡油覆盖，保存于2-8℃冰箱或室温中。可保存1-2年。霉菌、白色念珠球菌：接种于pda培养基中，28℃培养24-48小时，加入无菌石蜡油覆盖，保存于2-8℃冰箱或室温中。可保存1-2年。链球菌属：接种于羊血琼脂，36±1℃培养24-48小时，加入无菌石蜡油覆盖，保存于2-8℃冰箱或室温中。可保存1-2年。副嗜血杆菌、淋病奈瑟菌(需5-10%co2环境)、脑膜炎奈瑟菌(需5-10%co2环境)、流感嗜血杆菌接种于巧克力琼脂，36±1℃培养24-48小时，加入无菌石蜡油覆盖，保存于2-8℃冰箱或室温中。可保存1-2年。分枝杆菌属：接种于改良罗氏琼脂或middlebrook琼脂36±1℃培养7天，加入无菌石蜡油覆盖，保存于2-8℃冰箱或室温中。可保存1-2年。
4.菌种制备。菌种制备按照批准的制备计划执行。制备中要按规范要求操作，同时做好工作记录。记录内容包括：菌种名称，传代标识、制备数量。在制备容器上作出明确表示。 具体菌种制备方法如下：可以麦氏比浊管计数每ml菌液的菌数
1）大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、假单胞杆菌属、沙门氏菌属、副伤寒沙门氏菌、李斯特氏菌属、蜡样芽胞杆菌、八叠球菌、短芽孢杆菌、大肠杆菌hb101、大肠杆菌dh、猪肺疫、禽多杀性巴氏杆菌（禽霍乱）、猪丹毒、大肠杆菌o157、大肠菌群、产气肠杆菌、志贺氏菌属；把各种细菌菌种划线接种于营养琼脂平板上，36±1℃培养18-24小时，挑取单菌落接种于10ml营养肉汤中，36±1℃培养18-24小时，计数出每ml营养肉汤中的细菌数。把菌液保存于2-8℃，此菌液可保存7-10天，每10天重新挑取单菌落接种于10ml营养肉汤中， 36±1℃培养18-24小时，用生理盐水稀释到10-7，计数出10-6/0.1ml、10-7/0.1ml营养肉汤中的细菌数。
2）产气荚膜梭菌、梭杆菌属、拟杆菌属等厌氧菌、厌氧消化链球菌等厌氧菌直接接种于10ml液体硫乙醇酸盐培养基中，36±1℃培养18-24小时，计数出每ml液体硫乙醇酸盐培养基中的细菌数（在厌氧条件下培养）。
3）酵母菌、霉菌和白色念珠球菌：接种于pda培养基中，28℃培养24-48小时，挑取单菌落接种于10ml葡萄糖蛋白胨培养基中，28℃培养24-48小时，用ypd琼脂计数出每ml葡萄糖蛋白胨培养基中的菌落。把菌液保存于2-8℃，此菌液可保存7-10天，每10天重新挑取单菌落接种于10ml葡萄糖蛋白胨培养基中，28℃培养24-48小时，用生理盐水稀释到10-7，计数出10-6/0.1ml、10-7/0.1ml葡萄糖蛋白胨培养基中的菌数。
4）链球菌属：接种于脑心浸液中36±1℃培养18-24小时，计数出每ml脑心浸液中的细菌数。把菌液保存于2-8℃，此菌液可保存7-10天，每10天重新挑取单菌落接种于10ml脑心浸液中， 36±1℃培养18-24小时，用生理盐水稀释到10-7，计数出10-6/0.1ml、10-7/0.1ml脑心浸液中的细菌数。
5）副嗜血杆菌、淋病奈瑟菌(需5-10%co2环境)、脑膜炎奈瑟菌(需5-10%co2环境)、流感嗜血杆菌接种于巧克力琼脂，36±1℃培养18-24小时，用0.9%无菌氯化钠溶液稀释，经比浊后制成每1ml含菌数约相当于100～1000cfu的菌悬液。
6) 分枝杆菌属：接种于改良罗氏琼脂或middlebrook琼脂36±1℃培养7天，用0.9%无菌氯化钠溶液将上述增菌培养后的质控菌种的新鲜培养物制成1.0~3.0×103cfu/ml的菌悬液，作为工作菌液。
5．菌种的标识和使用期限：标识：菌种代数的计算为干粉菌种为第0代，转接一次斜面加一代。具体标识为：例单增李斯特氏菌atcc19114第0代，表识为单增李斯特氏菌atcc19114-0，代表识为单增李斯特氏菌atcc19114-1；代有12支，则表识为单增李斯特氏菌atcc19114-1-1、……、单增李斯特氏菌atcc19114-1-12；使用期限：传代次数不得超过5代，菌种已变异或生化鉴定不符合；
6.菌种使用。菌种管理员，每月领取1支代(或第二代、第三代)菌种。再根据以上方法制备工作菌液，分发给实际使用者，实际使用者领用前应充分考虑重复实验的需要。同一实验要选择同代菌种，保证实验的可比性。领用菌种要详细登记，领用人要签字，并注明领用时间。
7.菌种处理。实验完毕的菌种物和污染物应严格按照三废处理规定执行。提供给外部的菌种必须经公司总经理批准，按规定要求包装运输。严禁私自对外提供菌种。
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